科学における位相コントラストイメージングの利用方法

位相差顕微鏡の原理

位相コントラストイメージングの基本的な原理は、標本内の屈折率の違いを利用することです。透明な標本のさまざまな部分を通過する光は、さまざまな程度の位相シフトを経験します。通常、人間の目には見えないこれらの位相シフトは、振幅または強度の違いに変換され、画像にコントラストを生み出します。

この変換は、顕微鏡内の特殊な光学部品によって実現されます。これらの部品には、コンデンサー内の位相環と対物レンズ内の位相板が含まれます。これらの要素は連携して光波の位相を操作します。

フリッツ・ゼルニケがこの技術を開発し、1953 年にノーベル物理学賞を受賞しました。彼の革新的なアプローチは顕微鏡法に革命をもたらし、それまで見えなかった構造を視覚化することを可能にしたのです。

主要コンポーネントとセットアップ

位相差顕微鏡を正しく設定することは、最適な画像を得るために不可欠です。主なコンポーネントは、コンデンサー環、対物位相板、および光源です。これらのコンポーネントを適切に配置することが、高品質の位相差画像を生成するために不可欠です。

• コンデンサー環状部:このコンポーネントはコンデンサー内のリング状の開口部で、照明光を中空の円錐に制限します。この円錐状の光が試料を通過します。
• 対物位相板:対物レンズ内にある位相板は、回折光に対する非回折光の位相を変更します。これにより、画像に表示されるコントラストが作成されます。
• 光源:均一な照明と最適な画質を得るには、安定した適切に配置された光源が必要です。

適切な位置合わせを確実に行うには、コンデンサー環を対物レンズの位相リングに対して中央に配置する必要があります。この位置合わせは通常、センタリング望遠鏡またはベルトラン レンズを使用して行います。適切な位置合わせが行われないと、位相コントラスト効果が最適にならず、画像品質が低下します。

位相コントラストイメージングの最適化

位相コントラスト画像の品質に影響を与える要因はいくつかあります。これには、対物レンズの選択、コンデンサーの開口数、マウント媒体の屈折率が含まれます。これらのパラメータを最適化すると、画像の鮮明度と解像度が大幅に向上します。

• 対物レンズの選択:位相差顕微鏡用に特別に設計された対物レンズを選択します。これらのレンズには適切な位相板が付いています。
• 開口数:コンデンサーの開口絞りを調整して、解像度とコントラストのバランスを最適化します。絞りを閉じるとコントラストは上がりますが、解像度は下がります。
• マウント媒体:マウント媒体の屈折率は位相シフトの度合いに影響するため、慎重に考慮する必要があります。

さらに、標本が適切に準備され、取り付けられていることを確認してください。気泡やゴミが光路を妨げ、画像の品質が低下する可能性があります。光学系の清潔さも非常に重要です。

対物レンズとコンデンサー レンズを定期的にクリーニングすると、アーティファクトを防ぎ、最適なパフォーマンスを確保できます。この目的には、レンズ ペーパーと適切なクリーニング液を使用してください。

生物科学への応用

位相差顕微鏡は、生物科学において生きた細胞や微生物を観察するために広く使用されています。これにより、研究者は染色を必要とせずに細胞分裂、運動性、形態などの細胞プロセスを研究できます。これは特に長期観察に有効です。

• 細胞培養:細胞培養における細胞の成長、形態、および行動を監視します。
• 微生物学:細菌、真菌、その他の微生物を染色せずに観察します。
• 寄生虫学:生物学的サンプル内の寄生虫を特定し、研究します。

たとえば、研究者は位相差顕微鏡を使用して、さまざまな薬剤や治療法が細胞に与える影響をリアルタイムで観察できます。これにより、これらの物質の作用メカニズムに関する貴重な洞察が得られます。この技術は非侵襲的であるため、敏感な生物学的サンプルの研究に最適です。

発生生物学では、位相差顕微鏡を使用して胚や組織の発達を研究します。研究者はサンプルを壊すことなく細胞の動きや分化のプロセスを観察できます。

材料科学への応用

位相コントラストイメージングは​​主に生物学で使用されていますが、材料科学にも応用されています。屈折率がわずかに異なる透明または半透明の材料を視覚化するために使用できます。これは、ポリマー、薄膜、その他の材料の研究に特に役立ちます。

• ポリマーフィルム:ポリマーフィルムの構造と形態を調べます。
• 光学材料：光学材料の均質性と欠陥を分析します。
• コロイド懸濁液:コロイド懸濁液中の粒子の挙動を研究します。

位相差顕微鏡を使用することで、材料科学者は破壊的な手法を必要とせずに、これらの材料の内部構造と特性についての洞察を得ることができます。これにより、非破壊的な分析と特性評価が可能になります。

たとえば、この技術は、ポリマーフィルム内の密度や組成のばらつきを特定するために使用できます。このばらつきは、ポリマーフィルムの機械的特性や光学的特性に影響を与える可能性があります。この情報は、製造プロセスを最適化し、材料の性能を向上させるために役立ちます。

利点と限界

位相差顕微鏡法は、特に染色されていない標本の場合、従来の明視野顕微鏡法に比べていくつかの利点があります。ただし、考慮すべき制限もあります。これらの利点と制限を理解することは、適切な顕微鏡法を選択する上で非常に重要です。

• 利点:
  • 透明で染色されていない標本の視覚化を可能にします。
  • 非侵襲性であり、サンプルの準備は必要ありません。
  • 細胞構造やその他の透明材料に優れたコントラストを提供します。
• 制限事項:
  • 屈折率の差が大きい物体の周囲ではハロー効果が発生する可能性があります。
  • 光散乱のため厚い標本には適していません。
  • 位相コントラスト効果により、画像の解釈が困難になる場合があります。

ハロー効果とは、物体の端の周囲に現れる明るいまたは暗い縁のことで、細かい部分が見えにくくなることがあります。このアーティファクトは位相操作プロセスの結果です。顕微鏡の設定を慎重に最適化することで、ハロー効果を最小限に抑えることができます。

厚い標本の場合は、共焦点顕微鏡や微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡などの他の顕微鏡技術の方が適している場合があります。これらの技術は、より優れた光学セクショニング機能を提供します。